Amélioration de la Détection des Protéines à l’Échelle Cellulaire grâce à la Technologie ACE

La technologie ACE, qui repose sur l’amplification des signaux par ADN, représente une avancée majeure dans le domaine de la cytométrie de masse, offrant des perspectives inédites sur divers processus biologiques et pathologiques.

Évolution de la Cytométrie : De la Cytométrie en Flux à la Cytométrie de Masse

Depuis les années 1950, la cytométrie en flux, une technique développée par Wallace Coulter, a été utilisée pour analyser différents types de cellules immunitaires dans des études de recherche et des échantillons sanguins humains. Cette méthode a considérablement enrichi notre compréhension du développement des cellules immunitaires et a ouvert de nouvelles voies pour évaluer la santé humaine ainsi que pour diagnostiquer divers cancers du sang. Au fil du temps, la cytométrie en flux a été étendue à l’analyse d’autres types cellulaires.

Dans la cytométrie en flux traditionnelle, les protéines présentes à la surface des cellules et à l’intérieur de celles-ci sont détectées à l’aide de molécules d’anticorps liées à des sondes fluorescentes. Bien que cette méthode offre une sensibilité au niveau des cellules individuelles, elle est limitée dans la détection de plusieurs protéines en raison du nombre restreint de fluorophores pouvant être distingués dans le spectre lumineux fluorescent.

La Révolution de la Cytométrie de Masse

Avec l’introduction de la cytométrie de masse en 2009, il est devenu possible de quantifier simultanément jusqu’à 50 protéines dans des cellules uniques, permettant une analyse plus fine des identités cellulaires et de leurs états physiologiques. Dans cette technique, les anticorps sont associés à des isotopes métalliques non radioactifs, qui peuvent être quantifiés dans différents canaux d’un instrument de cytométrie de masse en fonction de leur masse. Cependant, la cytométrie de masse, ainsi que la cytométrie de masse d’image (IMC), qui visualise les protéines cellulaires dans des coupes de tissus intactes, souffrent d’une sensibilité réduite par rapport à la cytométrie en flux et à la microscopie à fluorescence.

Une Nouvelle Avancée : La Technologie ACE

Après 15 ans de recherche, une collaboration entre l’Institut Wyss de l’Université de Harvard, le MIT et l’Université de Toronto a abouti à une méthode qui améliore considérablement la sensibilité de la cytométrie de masse et de l’IMC grâce à la nanotechnologie ADN. En appliquant une nouvelle technologie d’amplification des signaux appelée « Amplification par Extension Cyclique » (ACE) aux codes-barres ADN liés aux anticorps, les chercheurs ont réussi à amplifier les signaux protéiques produits par les isotopes métalliques liés aux anticorps de plus de 500 fois, tout en détectant simultanément plus de 30 protéines différentes avec une grande sensibilité.

Cette méthode innovante a permis de détecter quantitativement des protéines rares, d’explorer des changements biologiques complexes dans les tissus et d’étudier comment des réseaux entiers de protéines interconnectées, régulant les fonctions des cellules immunitaires, réagissent à des stimuli et à des conditions pathologiques. Lorsqu’elle est appliquée à l’IMC, l’ACE a également permis d’identifier des types cellulaires et des compartiments tissulaires dans des sections histologiques, ainsi que des modifications de l’organisation tissulaire liées à la pathologie de la maladie polykystique des reins. Ces résultats ont été publiés dans la revue Nature Biotechnology.

Une Sensibilité Accrue pour des Analyses Plus Précises

Selon Peng Yin, membre du corps professoral de l’Institut Wyss et responsable de l’étude, « l’ACE comble une lacune essentielle dans l’analyse cytométrique : en améliorant la sensibilité de la cytométrie de masse, elle permet une plateforme d’analyse des cellules uniques qui atteint simultanément une haute sensibilité, un haut multiplexage et un haut débit. Les opportunités qu’elle ouvre pour l’étude des cellules uniques en suspension et des tissus intacts avec des approches hautement multiplexées et sensibles peuvent offrir une compréhension beaucoup plus approfondie des processus biologiques normaux et pathologiques. »

Une Technologie Prometteuse pour l’Avenir

Auparavant, Yin et son équipe avaient développé plusieurs technologies d’imagerie alimentées par ADN, capables de révéler le fonctionnement interne des cellules avec une résolution ultra-élevée au niveau de la molécule unique. Cependant, les structures d’ADN créées par ces méthodes n’étaient pas suffisamment robustes pour résister aux conditions relativement sévères utilisées dans la cytométrie de masse.

ACE résout les problèmes de sensibilité actuels de la cytométrie de masse en permettant aux chercheurs d’associer des molécules d’anticorps à un nombre considérablement accru d’isotopes métalliques par rapport à la cytométrie de masse conventionnelle. Cela facilite grandement la quantification d’une large gamme de protéines à faible abondance, ce qui était un défi avec les approches précédentes. En utilisant des techniques inspirées de leurs travaux antérieurs, les chercheurs ont pu synthétiser des concatamères linéaires in situ à travers un cycle thermique contrôlable.

la technologie ACE représente une avancée significative dans le domaine de la biologie cellulaire, promettant d’améliorer notre compréhension des mécanismes biologiques complexes et des maladies, tout en ouvrant la voie à de nouvelles recherches et applications cliniques.

Amplification des Signaux pour une Cytométrie de Masse de Haute Sensibilité

Une nouvelle méthode a été développée pour amplifier des signaux initiaux, permettant une augmentation de plus de 500 fois. Pour stabiliser l’ensemble du complexe ACE et garantir son intégrité lors des analyses de cytométrie de masse, les chercheurs ont utilisé un agent de liaison chimique pour relier les courtes doubles brins formés entre le support et les brins détecteurs ajoutés. « En suivant cette approche, nous avons conçu un panel de 33 séquences ACE distinctes (orthologues) dont la synthèse n’interfère pas les unes avec les autres, et nous l’avons appliqué à trois types d’analyses totalement différents », a déclaré Sheng, membre de l’équipe de recherche.

Exploration des Transitions Cellulaires

La première application de l’ACE a été d’étudier les transitions des cellules épithéliales vers des cellules mésenchymateuses, puis leur retour à l’état épithélial. Les transitions épithéliales-mésenchymateuses (EMT) et les transitions mésenchymateuses-épithéliales (MET) se produisent durant le développement embryonnaire, mais la première est également observée lorsque les tumeurs deviennent invasives et métastatiques. En analysant 32 marqueurs épithéliaux et mésenchymateux, ainsi que des molécules de signalisation et des facteurs de transcription rares dans des cellules de cancer du sein de souris, les chercheurs ont pu éclairer ces processus. « L’ACE nous a permis de profiler simultanément les niveaux de facteurs de transcription à faible abondance avec des marqueurs reflétant les états physiologiques et de signalisation des cellules individuelles. Cela a conduit à une compréhension plus précise de la manière dont les programmes moléculaires dans l’EMT et le MET sont influencés par des variations dans les quantités de facteurs de transcription clés, tels que Zeb-1 et Snail/Slug », a expliqué Sheng.

Analyse des T-Cellules

Dans un second exemple, l’équipe a examiné le fonctionnement interne des T-cellules. L’activation des récepteurs de T-cellules (TCR) à leur surface déclenche un réseau complexe de protéines de signalisation intracellulaires. L’analyse de ces réponses de signalisation à l’échelle de la cellule unique a été un défi, en partie en raison de la petite taille des T-cellules. Les protéines individuelles de ce réseau sont activées par des résidus de phosphate, ajoutés par d’autres protéines du réseau, généralement appelées kinases. Ces protéines activées phosphorylent d’autres protéines, entraînant des changements dans le comportement des T-cellules, par exemple, en réponse à des pathogènes ou à des cellules cancéreuses. Les chercheurs ont appliqué l’ACE à un panel de 30 anticorps se liant spécifiquement à des motifs phosphorylés dans les protéines du réseau TCR, impliquées dans le stress, l’inflammation, la prolifération cellulaire et d’autres réponses. « Grâce à l’analyse de cytométrie de masse améliorée par l’ACE, nous avons capturé des instantanés quantitatifs des variations dynamiques du réseau TCR dans des T-cellules humaines primaires. Cela nous a permis d’étudier les variations individuelles dans le timing et la durée des événements d’activation des T-cellules », a déclaré Lun.

Paralysie des T-Cellules Induite par des Blessures

Les chercheurs ont également utilisé le même panel d’anticorps amélioré par l’ACE pour étudier un phénomène connu sous le nom de « paralysie des T-cellules induite par des blessures ». Les T-cellules exposées à des blessures dans leur environnement, comme celles causées par des interventions chirurgicales majeures, deviennent souvent immunosuppressives. Pour comprendre comment le réseau TCR provoque cela, l’équipe de Yin a collaboré avec le Dr Michael Yaffe, professeur à MIT, qui s’intéresse à la manière dont le microenvironnement autour des sites de blessures tissulaires supprime le système immunitaire. Yaffe a fourni des échantillons de « liquide de drainage postopératoire » (POF) provenant de patients ayant subi une chirurgie. En stimulant les T-cellules avec les POF ainsi que leurs TCR, les chercheurs ont pu isoler des changements distincts dans le réseau qui entraînent l’arrêt de la division des T-cellules et leur épuisement.

Analyse Spatiale des Protéines dans les Sections Tissulaires

Enfin, l’équipe a exploré l’utilité de l’ACE pour l’analyse spatiale des protéines dans des sections de tissus, en se concentrant sur le rein humain. L’analyse du tissu rénal par microscopie de fluorescence est difficile en raison de son autofluorescence intense, et la cytométrie de masse traditionnelle manque de sensibilité. Les chercheurs ont développé un panel de 20 anticorps améliorés par l’ACE pour divers marqueurs rénaux et l’ont utilisé pour examiner des sections du cortex rénal d’un patient atteint de maladie polykystique des reins. Cette approche, en collaboration avec le Dr Hartland Jackson, expert en imagerie multiplexée, a permis d’identifier les différents types cellulaires et leur organisation au sein des tubules proximaux et distaux, des canaux collecteurs et des glomérules filtrants. « Nous avons découvert de nouvelles caractéristiques spécifiques à la maladie concernant l’organisation cellulaire et tissulaire, et nous avons constaté que le marqueur de cellules souches Nestin, également associé aux troubles rénaux, était exprimé de manière très hétérogène à travers les glomérules », a déclaré Lun. « Cela pourrait signifier que différentes parties du tissu traversent simultanément différentes étapes pathologiques. »

Conclusion

Cette nouvelle approche de cytométrie de masse développée par l’équipe de Peng Yin et ses collaborateurs démontre une fois de plus la puissance de la nanotechnologie ADN pour améliorer une technique existante, très pertinente pour les soins cliniques, et pour l’élever à un niveau de sensibilité et de spécificité bien supérieur. Cette méthode relativement simple ouvrira la voie à de nouvelles perspectives sur le fonctionnement des cellules, des tissus et des organes, tant en santé qu’en maladie.

Référence : « L’amplification du signal par extension cyclique permet une cytométrie de masse à cellule unique de haute sensibilité » par Xiao-Kang Lun et al., 29 juillet 2024, Nature Biotechnology. DOI : 10.1038/s41587-024-02316-x